Les premières tentatives de colonisation de la région depuis les Andes remontent à 1473, quand l'Inca Tupac Yupanqui y envoya une expédition qui fut repoussée par les féroces Tacana, les ancêtres des communautés actuelles d'Ese-Eja (l'une d'entre elles étant "Infierno", à deux heures en aval du Libertador Tambopata Lodge). En dépit de cet épisode, les Incas continuèrent à commercer pacifiquement avec bon nombre de tribus plus amicales et ils gardaient de grandes valeurs spirituelles envers la forêt.

Avec l'arrivée des Conquistadors, plusieurs expéditions vers la forêt furent entreprises, le plus souvent à la recherche du Paititi, la cité d'or mythique réputée pour être cachée quelque part dans la jungle amazonienne.

Entre 1567 et 1569, Juan Alvarez Maldonado explora largement la région de la
rivière Madre de Dios jusqu'à la rivière Heath, à la frontière avec la Bolivie. Il revint finalement, frustré par les difficultés, les maladies et les Tacana. La capitale de la province, Puerto Maldonado, fut nommée d'après lui.